Examenul hematologic la Reptile

Noţiuni introductive

Introducere

În ultimii ani, la cabinetele veterinare au început să apară din ce în ce mai multe animale exotice printre care se numără și multe reptile. Un diagnostic corect necesită efectuarea testelor paraclinice. Astfel nevoia de veterinari care să cunoască tehnici eficiente și rapide, adaptate la reptile este în plină expansiune.  Examenul hematologic la reptile prezintă multe dificultăți deoarece numărul total de elemente variază în funcție de specie, sex, vârstă, mediul din care provine și contenția efectuată în timpul prelevării de sânge (la crocodili). De asemenea morfologia tipurilor celulare sanguine diferă de la o specie la alta, de la un individ la altul și chiar la același individ.

Recoltarea sângelui

Reptilele variază în dimensiuni pornind de la cea mai mică, cameleonul de Madagascar, până la formidabilul crocodil de Nil și pot cântări între 3g și 700kg. Pentru o numărare de celule sanguine (CBC) este nevoie de aproximativ 0.3 mL de sânge. Volumul de sânge la reptile reprezintă între 5% și 8% din greutatea corporală și doar 10% din volumul de sânge poate fi recoltat de la un pacient sănătos.

De exemplu, un șarpe de 80g are un volum sanguin de 6,4 mL, astfel se pot recolta maxim 0,64mL. De la pacienții cu o greutate mai mică de 50g doar o picătură de sânge se poate folosi. Locurile de elecție sunt multiple și diferă în funcție de specie. La șarpe, pentru cei mari, se preferă vena coccigiană ventrală, iar acul se introduce cât mai aproape de cloacă (la femele)  între solzi perpendicular pe piele.  La șerpii de dimensiuni  mici se face puncție cardiacă. Pentru țestoase există patru locații comune pentru flebocenteză: sinusul occipital, vena jugulară, sinusul venos coccigian dorsal și sinusul venos subvertebral. La șopârle se poate recolta din vena coccigiană ventrală (la șopârlele mari) și din vena abdominală (la șopârlele mici). Pentru cantități mici de sânge se recomandă heparinizarea seringii. Dacă proba este recoltată pe anticoagulant se recomandă determinarea hematocritului. Acesta se determină ușor, fără a se număra eritrocitele.

1

Fig.1 Metoda acoperire-alunecare

Frotiul se efectuază, de preferat, imediat după recoltare. Metoda tradițională nu se pretează întrucât, în cazul sângelui de reptilă, celulele se pot liza. Ca alternativă se folosește metoda acoperire-alunecare (fig.1) Se utilizează colorațiile uzuale, Dia-Quick Panoptic sau Wright-Giemsa.

Numărarea leucocitelor

Numărarea leucocitelor prezintă unele dificultăți. Atât eritrocitul cât și trombocitul de reptilă prezintă nucleu. Astfel folosirea aparatelor automate de numărare nu este eficientă și oferă rezultate eronate. În literatura de specialitate sunt menționate următoarele tehnici: Metoda Phloxine B, Metoda Natt-Herrick și numărarea estimativă a leucocitelor. Majoritatea laboratoarelor utilizează ca metodă numărarea cu hemocitometru a leucocitelor în prealabil colorate (primele două menționate). O metodă precisă și mai puțin costisitoare  este reprezentată de numărarea estimativă pe frotiu. Frotiul colorat se fixează la microscop și folosind obiectivul de 40x se caută zonele cu densitate celulară moderată. Zonele cu densitate mare trebuiesc evitate la numărare. Se numără leucocitele din zece câmpuri, evitând leucocitele deteriorate. Dacă variația între câmpuri este mai mare de 10% se recomandă să se înlocuiască cu alte câmpuri. Dacă frotiul este prea mic sau de calitate inferioară se pot număra mai puține câmpuri dar precizia este mai mică. Pentru a obține numărul total de leucocite se impune următoarea formulă:

Suma leucocitelor/Numărul de câmpuri  x  2000  =  Numărul total de leucocite

Formula Leucocitară

Cunoașterea morfologiei fiecărui tip celular din linia albă este obligatorie pentru efectuarea unei formule leucocitare corecte. Leucocitele se împart în două mari clase: mononucleare și granulocite.

Mononuclearele sunt reprezentate de limfocit, monocit, azurofil , iar heterofilul, eozinofilul și bazofilul fac parte din linia granulocitară. Se recomandă identificarea fiecărui tip celular de pe frotiu înainte de numărarea acestora pe categorii deoarece tinctorialitatea acestora poate varia în linii mari în funcție de cum s-a realizat colorația.

Limfocitele pot fi mari și mici pe același frotiu (fig. 2). Nucleul este excentric de culoare bazofilă. Din punct de vedere morfologic se aseamănă mult cu limfocitul de la mamifere. Prezintă un strat subțire de citoplasmă transparentă, raportul nucleu/citoplasmă fiind 1:1. Limfocitele de iguană au citoplasmă bazofilă. Pot fi confundate cu trombocite sau eritrocite tinere, dar trombocitele apar de obicei aglutinate pe frotiu și au citoplasma clară, iar eritrocitele tinere au nucleul situat central. stora poate varia în linii mari în funcție de cum s-a realizat colorația.

2

Fig.2. Limfocit stânga sus, eritrocit tânăr stânga jos, eritrocit matur dreapta (țestoasă)

Monocitele sunt celule mari. Nucleul are formă sferică, ovală sau de potcoavă (fig.3). În citoplasma gri-albăstruie se pot găsi vacuole clare. Prezintă cromatină mai puțin condensată și raport nucleu/citoplasmă mai scăzut comparativ cu limfocitele.

3

Fig. 3. Monocit de varan în centru

Azurofilul (fig.4) este o celulă specială care se se observă din abundență în sângele de șarpe. Unii autori afirmă că ar fi un stadiu precursor heterofilului, dar majoritatea consideră că azurofilul are origine în linia monocitară. Comparativ cu monocitul, este mai mic și prezintă granulații fine de culoare roz în citoplasmă.

4

Fig. 4. Azurofil la șarpe în centru jos

Heterofilul reprezintă echivalentul funcțional al neutrofilului de la mamifere. Aspectul acestuia diferă mult de cel al neutrofilului. Heterofilul prezintă nucleu sferic, segmentat fiind doar cel de la iguană, și este situat excentric. În citoplasmă se pot observa granulații ovale de culoare intens eozinofilă. Dimensiunile sunt cuprinse între 10-23 μm  în funcție de specie.

Eozinofilul este dificil de găsit la unele specii (șarpe); la acestea prezența lui fiind un indicator patologic. Nucleul este sferic, bazofil, cu margini ușor dantelate și situat excentric. Citoplasma este transparentă  și granulele sunt sferice. În mod paradoxal, la varan granulele eozinofilului sunt bazofile (fig.5), dar la restul speciilor de reptile culoarea variază de la mov la roșu. Diametrul este cuprins între 9-20 μm.

5

Fig. 5. Eozinofil de varan centru sus, eritrocit centru jos, artefact de colorare stânga

La broasca țestoasă heterofilul și eozinofilul au aspect aproape identic (fig.6). Granulele au aceeași tinctorialitate și forma acestora este greu de distins. În acest caz se urmărește abundența granulelor în celule; heterofilul are foarte multe granule care de obicei acoperă și nucleul. De asemenea eozinofilul are citoplasmă transparentă astfel la microscop se observă doar granulele și celula pare a fi anfranctuoasă.

6

Fig.6. Heterofil  de țestoasă centru (poza mare), eozinofil de țestoasă dreapta jos

Bazofilul este obervat pe frotiurile efectuate din sângele periferic, fiind mult mai des întâlnit la reptile comparativ cu mamiferele. Granulele bazofilului sunt metacromatice, însemnând că își schimbă tinctorialitatea în funcție de celulele din jur, în general mov, sferice, mici, foarte multe și în cele mai multe cazuri acopera nucleul (fig. 7). Nucleul este sferic ceea ce îl diferențiază de bazofilul mamiferelor al cărui nucleu este lobulat. Uneori citoplasma apare vacuolată, spumoasă, dar tot se observă câteva granule colorate mov intens (fig.8). Prezintă imunoglobuline la suprafața membranei celulare. Rolul bazofilului la reptile nu este bine cunoscut.

7

Fig. 7. Bazofil de varan centru

8

Fig. 8. Bazofil de ţestoasă centru 

Eritrocitele, după cum s-a menționat mai sus, sunt nucleate. De aceea este comun să găsești mitoze eritrocitare în sângele de reptilă. Comună este și prezența eritrocitelor tinere care se diferențiază de eritrocitele adulte prin tinctorialitate, fiind mai eozinofile, iar dimensiunea nucleului este mai mare la cele tinere (fig.9).

9

Fig. 9. Eritrocite tinere și mature

De asemenea se pot observa incluziuni intracitoplasmatice. Acestea pot apărea din cauza particulelor virale sau a hemoparaziților, dar pot fi și artefacte de colorare (fig.10).

10

Fig. 10. Incluziuni eritrocitare parazitare

Variațiile Hemogramei

Specia, colorarea frotiului, tehnica de evaluare, starea de sănătate, starea de întreținere, vârsta, stadiul ciclului sexual, nivelul stresului, sexul, locul de elecție, sezonul, stadiul de hibernare, statusul captiv și factorii de mediu pot afecta parametrii numerici ai hemogramei.

Într-un studiu făcut pe o specie de țestoasă (Hiemerys annandalii) s-a descoperit că masculii au un număr total de leucocite (WBC) crescut față de femele. În contrast cu acest studiul este cel făcut pe cobre (Naja naja) în care femelele au un număr total de leucocite mai mare decât masculii. La anumite specii de țestoase (Cuora flavomarginata) masculii au mai multe eozinofile și femelele au mai multe monocite. Atât sexul cât și vârsta influențează acești parametrii, tineretul prezentând mai puține limfocite și mai multe granulocite, iar la reptilele bătrâne s-au identificat puține monocite.

În alt studiu s-a evidențiat importanța activității biologice. Femelele speciei Dermochelys coriacea (țestoasă) au procentul eozinofilelor mai scăzut comparativ cu Caretta mydas (altă specie de țestoase). Acest lucru este atribuit faptului că D. coriacea sunt mai puțin expuse la helminți datorită dietei constituite din meduze.

Condițiile de mediu au impact asupra rezultatelor hemogramei. La țestoasele Ocadia sinenesis toți parametrii hematologici în afară de monocite variază în funcție de sezon. Reptilele captive ar putea avea valori diferite față de cele libere în cadrul aceleași specii. De exemplu, la țestoasele mediteranene Mauremys leprosa procentul de limfocite a fost estimat la 4,2-7,7% la cele libere și 57,8-64,9% la cele captive.

Țestoasă

(Trachemys)

Iguană

(Iguana iguana)

Boa

(Boa constrictor)

Hct (%) 25-33 30-45 20-40
WBC (x103/μL) 3,2-25,5 3-14 4-10
Heterofile (%) 36 40-70 20-65
Eozinofile (%) 11 0-1 0-3
Bazofile (%) 25-27 0,2 0-20
Limfocite (%) 24 20-45 10-60
Monocite (%) 0-1 0-2 0-3
Azurofile (%) 3-4 0-6

Tabel 1. Valori fiziologic normale

Hct – Hematocrit; WBC – Nr. Total de leucocite.

CONCLUZIE

Se poate afirma că tehnicile de numărare și identificare a celulelor sanguine la reptile sunt puține și într-un stadiu incipient de dezvoltare și testare, iar factorii care influențează parametrii hematologici sunt multiplii și interconectați. Cu toate acestea analizele oferă informații cruciale in elaborarea diagnosticului. Astfel, examenul hematologic al reptilelor devine treptat o necesitate în cadrul cabinetelor veterinare de animale de companie.

Autori Botuşan Maria, Cernea Cătălin, studenţi anul III la FMV Cluj-Napoca

Coordonator Dr.Orsolya Sarpataki, FMV Cluj-Napoca